Versuch 4: Biochemie I

Versuch IV, A: Qualitativer Nachweis verschiedener Kohlenhydrate

Kohlehydrate, speziell Mono- und reduzierende Disaccharide, können auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften mittels der folgenden Versuchsreihen klassifiziert oder, bei eindeutigen Ergebnissen, sogar identifiziert werden.

Folgende Lösungen wurden mit der Fehling-, Barfoed-, Seliwanowreaktion sowie der Gärprobe getestet:

Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Saccharose, Apfelsaft und eine zu identifizierende Lösung X.

Bei den positiv getesteten Reaktionen wurde die Zeit notiert, die vom Erhitzen bis zum Farbumschlag gemessen wurde. Die jeweils längste Zeit pro Reaktionsart darf beim Test des Apfelsafts und des unbekannten Zuckers nicht überschritten werden. Dies ist wichtig, um falsch positive Ergebnisse auszuschliessen, die eventuell bei Überschreiten der Zeit durch Hydrolyse zustande kämen.

1. Fehling:

Ein positives Ergebnis zeigt sich durch einen Niederschlag von rotem Cu₂O. Dieses wird durch Mono- und reduzierende Oligosaccaride ausgefällt. Es hätte folglich die Glucose reagieren müssen und bei der Saccharose keine positive Reaktion geben dürfen. Eventuell wurden die beiden Zucker vertauscht. Auch möglich wäre es, dass die Saccharose vor dem Versuchsansatz bereits enzymatisch gespalten wurde und die Glucose ins noch nicht genug heiße Wasserbad gestellt wurde, was die Reaktionszeit verlängert hätte.

Die längste Reaktionsdauer der bekannten Zucker besitzt hier die Maltose, nämlich 22 sec.

X zeigte jedoch erst nach etwa doppelter Zeit eine Reaktion. Deshalb kann man nicht mit Sicherheit davon ausgehen, dass es sich nicht um ein falsch positives Ergebnis handelt.

Der Apfelsaft zeigte nach 15 sec eindeutig eine Reaktion. Somit enthält er eine der oben genannten Zuckerarten.

2. Barfoed:

Nur die Monosaccharide haben ein ausreichendes Reduktionspotential, um Cu₂O aus der Barfoed-Lösung auszufällen.

Wie erwartet, zeigte sich nur bei Glucose und Fructose ein roter Farbumschlag. Die daraus ermittelte maximale Reaktionszeit beträgt hier 120 sec. Innerhalb dieser reagierte der Apfelsaft, weshalb davon auszugehen ist, dass sich darin einer der beiden Zucker befindet.

X zeigte keine Reaktion, so dass nur noch Lactose, Maltose oder Saccharose dafür in Frage kommen.

3. Seliwanow:

Durch Kochen mit HCl entsteht aus Fructose über Zwischenstufen Hydroxymethylfurfural, welches mit Resorcin einen roten Niederschlag bildet. Nach längerem Kochen zeigen auch Saccharose und die Aldohexosen (Glucose) eine positive Reaktion.

Die Testergebnisse entsprachen insofern ganz den Erwartungen. Da die Apfelsaftprobe auch nach etwa 4 min ( wie die Fructose relativ schnell) einen roten Niederschlag aufwies, wird die Vermutung bestätigt, dass Fructose in Apfelsaft enthalten ist.

In der Probe X hatte sich im Gegensatz zu Saccharose kein roter Komplex gebildet.

Ob es sich bei X um Maltose oder Lactose handelt, kann durch die Gärprobe ermittelt werden.

4.   Gärprobe

Hierbei werden Bäckerhefe-Suspensionen mit den verschiedenen Zuckerlösungen gemischt, in Gärröhrchen abgefüllt und im Trockenschrank bei 35°C inkubiert.

Nach 15 min zeigten das Lactose- und Maltoseröhrchen und das Röhrchen mit der Testlösung X noch keine Gasentwicklung an, während sich bei den anderen Zuckern durch die Vergärung CO₂ gebildet hatte.

Nach 30 min hatte auch die Vergärung der Maltose eingesetzt.

Lactose und Testlösung zeigten jedoch weiterhin keine Gasentwicklung, wodurch X eindeutig als Lactose identifiziert war.

Die verwendete Hefe hat offenbar ein eingeschränktes Gärspektrum, da sie Lactose nicht verwerten kann. Eventuell besitzt dieser Stamm keine b-Galactosidase um das Disaccarid zu hydrolysieren.

Versuch IV, B: Enzymatische Spaltung von Stärke durch Amylasen

Bei diesem Versuch soll die pH-Abhängigkeit von enzymatischen Reaktionen untersucht werden.

Es wurden laut Skript Diastase-Stärke-Lösungen verschiedener pH-Werte hergestellt.

Den auf 30°C erwärmten Ansätzen wurden im 5 min-Abstand eine Probe entnommen und zu dieser Kaliumiodid-Lösung gegeben.

Die Abnahme der dunkelblauen Färbung des Iod-Stärke-Komplexes zeigt die Enzym-Aktivität an.

Farbton-Skala: ++++ (dunkelblau)  -  + (hell lila)

Die an Hand der Beobachtungen erstellte Tabelle zeigt kein sehr plakatives Ergebnis, doch lässt sich eine Tendenz ablesen: Die Lösung wird natürlich auf Grund der andauernden Amylase-Aktivität mit der Zeit zunehmend entfärbt. Wahrscheinlich liegt das pH-Optimum der Amylase eher im sauren Bereich um den pH-Wert 5, da ja auch im Magen saure Bedingungen herrschen.

Ungenauigkeiten bei der Erstellung der Tabelle resultieren sicherlich aus der subjektiven Abschätzung der Farbintensivitäten. Des weiteren konnten Fehler durch ungenaues Pipettieren entstehen oder da die Stärke nicht genügend gelöst wurde.

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Versuch 4: Biochemie I

A: Qualitativer Nachweis verschiedener Kohlehydrate

Durchführung

Mit Lösungen von Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Saccharose, Apfelsaft und eines unbekannten Zuckers wurde die Fehling-Probe, die Barfoed-Probe, der Seliwanow-Nachweis und die Gärprobe mit Hefe gemacht.

Ergebnis

Die Tabelle zeigt die Zeiten bis zur Reaktion (z.B. Kupferausfällung) in sec. bei den Verschiedenen Testverfahren.

Die Tabelle zeigt die Menge an entwickeltem C0₂ in den Gärröhrchen in mm. (An der Eichung der Röhrchen abgelesen)

Leer bedeutet, dass der Inhalt des Röhrchens unter die Eichung gesunken ist, und die C0₂-Menge nicht mehr quantitativ ablesbar ist. Die Gärung geht aber durchaus weiter.

Diskussion

-        Fehling: Saccharose ist kein reduzierendes Oligosaccharid, und sollte deshalb nicht anschlagen. Der Grund warum sich nach einer Weile trotzdem rötlicher Niederschlag bildete, kann nicht ermittelt werden, vermutlich war die Zuckerlösung verunreinigt, oder die Fehling-Lösung schon etwas alt.

-        Baerford: Wie zu erwarten reagieren nur die Monosaccharide (Fru. Gluc.) bei diesem Test. Der Apfelsaft reagiert ebenfalls, da er Fructose enthält.

-        Seliwanow: Nur Fructose und Saccharose reagieren bei diesem Test, wobei eigentlich die Saccharose verzögert reagieren sollte, da hier erst das Disaccharid gespalten werden muss. Möglicherweise wurde hier ungenau gemessen.

-        Gärprobe: Gluc. Sacc. Fruc. und Apfelsaft wurden stark vergoren, die Röhrchen waren schon bei der 3. Messung fast nur noch mit Gas gefüllt. Maltose gärt recht langsam, Lactose und X werden nicht vergoren (die 0,2 mm kommen dadurch zustande, dass das Röhrchen am Anfang nicht ganz aufgefüllt wurde). Vermutlich fehlt diesem Hefestamm eine Hydrolase, welche Lactose in die Monomere spalten kann.

-        X: Aus dem Verhalten bei den drei Tests und der Gärprobe können wir schließen, dass es sich um Lactose handelt.

B: Enzymatische Spaltung von Stärke durch Amylasen

Durchführung

Wir setzen Stärkelösungen mit 3 verschiedenen pH-Werten an. Die Lösungen werden im 30°C Wasserbad mit Amylasen versetzt, und der Fortgang des Stärkeabbaus mittels KJ^.J₂ gemessen.

Ergebnis

Die Tabelle zeigt die Farbwerte der mit KJ^.J₂ versetzten Stärkelösungen zu den verschiedenen Zeitpunkten. Dies sind subjektive Werte, welche lediglich die Reihenfolge wiedergeben (heller/dunkler als) und keine quantitative Aussage haben. Je Heller der Farbton, desto mehr Stärke ist abgebaut worden.

Anlage 1 zeigt die Werte in einer numerischen Graphik

Diskussion

Bis zum Zeitpunkt 15 wurde vergessen, die Proben umzurühren. Dadurch hat sich offensichtlich Sediment gebildet, welches viel langsamer durch Amylasen abgebaut wurde als der gelöste Rest. Als dann bei der nächsten Messung umgerührt wurde, mischte sich das nicht abgebaute Sediment wieder in die Testlösung, deshalb wurde die Probe plötzlich wieder schwarz, obwohl sie zuvor schon heller war. Regelmäßiges Rühren führte zum erwarteten Ergebnis. Die Stärke wird bei pH 4 und 5 kontinuierlich abgebaut, bei pH 5 noch etwas schneller als bei 4. Dort liegt also das Wirkungsoptimum der Amylase. Bei pH 7 dagegen arbeitet sie so gut wie garnicht. Die Werte vor Zeitpunkt 20 sind zu ignorieren.

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