Versuch II, 1:

Der Pasteureffekt bei der Hefe

Glukose kann von der Hefe anaerob zu 2 CO2 und 2 Ethanol (Gärung mit einer Ausbeute von 2 ATP) und aerob zu 6 CO2 und 6 H2O (Atmung mit einer Ausbeute von 38 ATP) abgebaut werden.

Pasteur stellte fest, daß die Hefe in Gegenwart von Sauerstoff weniger Glukose verbraucht, als unter anaeroben Bedingungen. D.h., um dieselbe Energieausbeute zu erreichen, wird beim aeroben Abbau weniger Glukose verbraucht, als beim anaeroben.

Mit Hilfe von Warburg-Gefäßen kann eine Manometrische Messung durchgeführt werden, um das durch Atmung oder Gärung freigesetzte CO2 zu bestimmen.

Der Glukose-Verbrauch kann enzymatisch nach folgenden Reaktionen ermittelt werden:

                                               Glukoseoxidase

1.  Glukose + H2O + O2          ------------------->   Gukonsäure + H2O2

                                                 Peroxidase

2.  H2O2 + Chromogen red.        ------------------>    Chromogen ox. + 2 H2O

                  (farblos)                                                (blaugrün)

Der gebildete Farbstoff (=Chromogen ox) kann im Spektralphotometer bei 610 nm gegen den Nullwert qantitativ bestimmt werden.

Versuch:

1.     Manometrische Messung des bei Hefezellen durch Gärung bzw. Atmung freigesetzten CO2 Vergleich dieser Ergebnisse mit der quantitativen Bestimmung des Glukose-Verbrauchs

Versuchsdurchführung (im Detail siehe Skript)

zu 1. 0,25g Bäckerhefe wurde in 50ml demin. Wasser mit 125mg Glukose 1 Stunde geschüttelt, zentrifugiert und anschließend mit Na-Citratpuffer versehen.

Aus dieser Suspension wurden 3 verschiedene Ansätze und eine Kontrolle (für Luft- und Temperaturschwankung) laut folgender Tabelle für die Warburg-Apparatur hergestellt:

Nach Beobachtung der Leeratmung (ohne Glukose) wurde die Glukose zugekippt, und eine Stunde lang alle 10 Minuten die Druckänderung gemessen.

zu 2. Zur Glukosebestimmung wurden aus allen Gefäßen Proben entnommen, und mit einem Glukose-Reagenz (enthält Enzyme, Chromogen und Glukose-Standard-Lösung) versetzt.

Nach 30 Minuten Inkubation wurde die Extinktion des gebildeten Farbstoffs im Spektralphotometer bei 610 nm gegen den Nullwert gemessen.                                       

Ergebnis:

zu Gas-Volumen-Änderung (anaerob):          

Unter anaeroben Bedingungen ist Hefe in der Lage Gärung zu betreiben. Hierbei wird 1 Mol Glucose zu 2 Mol Ethanol und 2 Mol CO2 abgebaut, bei einer Ausbeute von 2 Mol ATP. Wegen der (im Vergleich zur aeroben Atmung) „geringen“ Energieausbeute muss „viel“ Glucose vergärt werden, um genügend Energie zu gewinnen.  Dies führt dann wiederum dazu, das dementsprechend mehr Gas (CO2) gebildet wird. Da dies das einzige Gas ist, das bei dieser Reaktion eine Rolle spielt, führt dies zu einem Anstieg des Gas-Volumens.

zu Gas-Volumen-Änderung (aerob):

Unter aeroben (O2) Bedingungen ist Hefe in der Lage Atmung durchzuführen. Hierbei wird 1 Mol Glucose zusammen mit 6 Mol O2 zu 6 Mol H2O und 6 Mol CO2 abgebaut, bei einer Energieausbeute von 36 mol ATP. Durch die „große“ (im Vergleich zur anaeroben Gärung) Energieausbeute muss von der Hefe viel weniger Glucose veratmet werden. Da bei der aeroben Atmung genausoviel Gas verbraucht (6 Mol O2) wie produziert (6 Mol CO2) wird, sollte man eigentlich keine Veränderung im Gas-Volumen erkennen können. In unserem Versuch allerdings war eine Gas-Volumen-Zunahme (allerdings viel geringer als unter anaeroben Bedingungen) festzustellen. Es wurde demnach mehr Gas produziert als verbraucht. Dies deutet darauf hin, dass wahrscheinlich doch noch etwas Gärung (aerobe Gärung!) gemacht wurde, allerdings deutlich weniger als unter anaeroben Bedingungen. (mehr dazu, siehe Gas-Volumen-Änderung (aerob + KOH))

zu Gas-Volumen-Änderung (aerob + KOH):

Aerobe Bedingungen bedeutet wiederum Atmung. KOH soll in diesem Versuch das gebildete CO2 „wegfangen“, so dass am Ende nur der Verbrauch der 6 Mol O2 gemessen werden sollte, was mit einer Abnahme des Gas-Volumens einhergehen sollte. Das Gas-Volumen war allerdings konstant, veränderte sich also so gut wie nicht im Vergleich zum Ausgangs-Gas-Volumen! Wie schon beim vorherigen Versuchsansatz (Gas-Volumen-Änderung (aerob)) ist mehr Gas produziert werden! Dieses Gas kann allerdings nicht das CO2 aus der Gärung sein, da jedes CO2 von KOH „weggebunden“ werden sollte. ??? Es liegt die Vermutung nahe, dass unsere Warburg-Gefäße undicht waren, oder aber unsere Hefe war etwas Besonderes (:-)).

Bestimmung der verbrauchten Glucose:

Ergebnis:         Unter anaeroben Bedingungen wurde mehr Glucose verbraucht als unter aeroben. Zu erwarten wäre allerdings ein deutlicherer Unterschied zwischen anaeroben und aeroben gewesen. 2a, 2b, 3a und 3b sollten in etwa den gleichen Glucose-Verbrauch zeigen. 1a und 1b sollten gegenüber allen anderen deutlich mehr Glucose verbrauchen. Dies wäre auch nach unseren Messergebnissen (siehe Graph) zu erwarten gewesen. Allerdings wurde dies aus uns unbekannten Gründen nicht erreicht. 

Nach Berechnung der Gasmenge lässt sich der genaue Glucoseverbrauch berechnen. Dies ist uns allerdings nur bei der anaeroben Gärung möglich.

Für das Berechnen des Glucose-Verbrauchs bei der aeroben Atmung, hätte man bei 3a und 3b einen O2-Verbrauch messen müssen. Dies war jedoch in diesem Versuch leider nicht der Fall.

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